QUANTIFICAÇÃO DE NEURÔNIOS GIEMSA+ DO JEJUNO DE RATOS EXPOSTOS AO DIABETES, TABAGISMO E HIPERCOLESTEROLEMIA TRATADOS COM Baccharis trimera  


1Flavio de Souza Júnyor, 2PAULA MONTANHINI FAVETTA, 3WESLEY ALVES TRINDADE , 4GRAZIELLI DE FATIMA SERENINI , 5NATALIA NAMIE MIZUGUCHI, 6RICARDO DE MELO GERMANO


1Discente do Instituto Federal do Paraná - Bolsista PEBIC-JR CNPq/UNIPAR
2Doutoranda em Ciência Animal com Ênfase em Produtos Bioativos da UNIPAR - Bolsista PROSUP/CAPES
3Mestrando em Ciência Animal com Ênfase em Produtos Bioativos da UNIPAR - Taxista PROSUP/CAPES
4Mestre em Ciência Animal com Ênfase em Produtos Bioativos pela UNIPAR
5Discente do Curso de Enfermagem da UNIPAR - Bolsista PIBIC
6Docente do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal com Ênfase em Produtos Bioativos da UNIPAR

Introdução: O plexo mioentérico, uma subdivisão do Sistema Nervoso Entérico (SNE), constitui uma cadeia linear de neurônios organizados em gânglios que se estende pelo trato gastrointestinal (TGI), controlando o peristaltismo (GUYTON; HALL, 2011; GARTNER, 2017). O SNE apresenta-se bastante sensível e vulnerável a lesões e pode ser afetado por diversas doenças, provocando alterações no funcionamento do TGI (FERREIRA; OLIVEIRA; ODA, 2015). Dentre elas, estão os fatores de risco associados às doenças cardiovasculares, como o diabetes mellitus (DM), tabagismo e dislipidemia (ADA, 2019; McCarthy et al., 2015; Pereira, 2014). Uma das terapias utilizadas para distúrbios relacionados ao TGI é o tratamento com a espécie Baccharis trimera, conhecida popularmente como carqueja, devido seus efeitos antioxidantes, hepatoprotetores e anti-inflamatórios (BELTRAME; et al., 2009; SOUZA et al., 2019).
Objetivo: Avaliar os efeitos do extrato de B. trimera sobre a população total de neurônios mioentéricos, corados pela técnica de Giemsa, do jejuno de ratos induzidos ao DM e expostos ao tabagismo e à dieta hipercolesterolêmica.
Material e Métodos: Todos os procedimentos realizados no presente estudo foram aprovados pelo comitê de ética da UNIPAR (protocolo n. 1000/2018). Foram utilizados 25 ratos machos da linhagem Wistar. Os animais foram divididos em cinco grupos (n=5/grupo): C- (animais normoglicêmicos, não dislipidêmicos e não tabagistas); C+ (diabéticos, dislipidêmicos e tabagistas, tratados com veículo); BT30 (animais diabéticos, dislipidêmicos e tabagistas, tratados com 30mg/kg de B. trimera); BT100 (animais diabéticos, dislipidêmicos e tabagistas, tratados com 100mg/kg de B. trimera) e BT300 (animais diabéticos, dislipidêmicos e tabagistas, tratados com 300mg/kg de B. trimera). A indução ao DM ocorreu após jejum de 12 horas, via intraperitoneal 60mg/kg de estreptozotocina. Após a indução do DM, os animais receberam dieta padrão comercial da marca Purina® com 0,5% de colesterol da Sigma-Aldrich® em 6,75ml de óleo de milho para cada 75g de ração comercial para a indução da dislipidemia. Em seguida, os animais foram expostos à inalação de ar filtrado ou fumaça de 9 cigarros comerciais, 5 dias por semana, durante 1 hora por dia, por quatro semanas. O tratamento com as diferentes doses de carqueja ocorreu nas últimas duas semanas de experimento, via gavagem, uma vez por dia, ressuspendido em água filtrada. Após quatro semanas de experimento, os animais foram submetidos a eutanásia, realizada por aprofundamento anestésico, utilizando isoflurano em câmara de saturação de 1-3%. Determinado o óbito foi realizada incisão ventral e coletado o jejuno para a marcação da população total de neurônios pela técnica de coloração básica de Giemsa. Após a fixação, o jejuno foi seccionado ao longo do eixo longitudinal em nível da inserção do mesentério, e microdissecado ao estereomicroscópio. Em seguida, foram desidratados em série crescente de álcoois, diafanizados em xilol, e colocadas entre lâmina e lamínula de vidro com resina sintética. Sob microscopia de luz utilizando-se de um aumento de 200x e de um sistema de análise de imagem de alta resolução, foram realizadas capturas de imagens de 120 campos microscópicos aleatórios por preparado de membrana, sendo contempladas igualmente as áreas mesentérica, intermediária e antimesentérica. Após a quantificação os dados obtidos foram analisados estatisticamente pela ANOVA e pós-teste Tukey.
Resultados: Foi encontrada redução significativa na quantidade média de neurônios totais presentes em mm² de preparos de membrana de jejuno nos grupos C+ (109,21) e tratados com a fração do extrato de carqueja (BT30 91,46; BT100 81,29; BT300 94,03), quando comparados ao grupo C- (163,82).
Discussão: De acordo com Tronchini et al. (2012), foi relatado a redução da população total de neurônios mioentéricos do jejuno de ratos induzidos ao DM após quatro meses de experimento, quando comparados aos normoglicêmicos. Além disso, Freitas et al. (2008), após o mesmo período de tempo, mencionaram uma redução de 37,9% na população total de neurônios de animais diabéticos em relação ao grupo não-diabético. No presente estudo, a redução dos neurônios foi significativa após quatro semanas de exposição ao diabetes, isto pode ser decorrente da associação do estado diabético a mais dois fatores de risco, a hipercolesterolemia e o tabagismo, acelerando o processo de redução neuronal. Pereira et al. (2008), em um modelo experimental semelhante ao de Freitas et al. (2008), observaram que densidade neuronal nitrérgica, neurônios inibitórios, não diferiram nos grupos, indicando a alta resistência dessa subpopulação neuronal à ação de radicais livres encontrados em concentrações elevadas no quadro de DM. Nesse sentido, a redução da população total de neurônios mioentéricos está atrelada, exclusivamente, a subpopulação de neurônios colinérgicos, neurônios excitatórios encontrados na parede do tubo digestório.
Conclusão: As diferentes doses de carqueja não apresentaram efeitos protetores sobre os neurônios mioentéricos, visto que houve uma redução significativa na população total de neurônios corados pela técnica de Giemsa.

Referências
AMERICAN DIABETES ASSOCIATION. Pharmacologic approaches to glycemic treatment: Standards of Medical Care in Diabetes—2019. Diabetes care, v. 42, n.1, jan. 2019.
BELTRAME, F. L. et al. Avaliação da qualidade das amostras comercias de Baccharis trimera L. (Carqueja) vendidas no Estado do Paraná. Acta Scientiarum Health Sciences, Maringá v. 31, n. 1, mai, 2009.
FERREIRA, P. E. B.; BELÉM, M. O.; ODA, J. Y. O efeito do uso de antioxidantes na prevenção e tratamento da neuropatia diabética no sistema nervoso entérico. Arquivo de Ciências de Saúde da UNIPAR, Umuarama, v. 19, n. 2, mai. 2015.
FREITAS, P. et al. Myenteric neurons and intestinal mucosa of diabetic rats after ascorbic acid supplementation. World Journal of Gastroenterology, v.14, n.42, nov. 2008.
GARTNER, L. P. Tratado de histologia. 4 ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2017.
GUYTON, A. C.; HALL, J. E. Tratado de Fisiologia Médica. 12 ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2011.
MCCARTHY, E. et al. Radiology and mesenteric ischaemia. Clinical radiology, v. 70, n. 7, jul. 2015.
PEREIRA, P. M. C. O tabaco e a doença inflamatória intestinal. 2014. Dissertação (mestrado) - Universidade do Porto, Portugal, 2014.
PEREIRA, R. V. F. et al. Vitamin E supplementation in rats with experimental diabetes mellitus: Analysis of myosin-V and nNOS immunoreactive myenteric neurons from terminal ileum. Journal of Molecular Histology, v. 39, out. 2008.
SOUZA, M. M. Q. et al. Baccharis trimera (Less.) DC: An Innovative Cardioprotective Herbal Medicine Against Multiple Risk Factors for Cardiovascular Disease. Journal of Medicinal Food, v. 23, n.6, jun, 2019.
TRONCHINI, E. A. et al. Supplementation with 0.1% and 2% vitamin e in diabetic rats: analysis of myenteric neurons immunostained for myosin-V and nNOS in the jejunum. Arquivo de Gastroenterologia, São Paulo, v. 49, n. 4, dez. 2012.